Cel badań / hipoteza

Celem projektu jest zastosowanie nowych technik precyzyjnego edytowania genomu w badaniach nad funkcją genów jęczmienia, kontrolujących ważne procesy fizjologiczne. Badania realizowane będą w oparciu o nowatorską, nie testowaną dotąd u jęczmienia technikę CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Technika ta zostanie wykorzystana w celu uzyskania roślin o zmienionym genotypie i fenotypie, poprzez indukcję ukierunkowanych (miejscowo-specyficznych) mutacji w dwóch genach – HvCKX1 i Nud, warunkujących ważne cechy użytkowe. Hipoteza badawcza zakłada, że zastosowanie konstrukcji genetycznych typu CRISPR/Cas, wprowadzonych na drodze stabilnej transformacji genetycznej, umożliwi uzyskanie roślin o zmienionym genotypie i fenotypie. Przeprowadzona zostanie analiza rodzaju i częstości uzyskanych mutacji, a także sposobu ich dziedziczenia w następnych pokoleniach generatywnych. Pozwoli to na oszacowanie skuteczności i wydajności techniki CRISPR/Cas w ważnym gatunku uprawnym. 

Metoda badawcza 

Termin „edytowanie genomu” odnosi się do różnych techniki inżynierii genetycznej, które stosowane są w celu wprowadzenia do genomu miejscowo-specyficznych modyfikacji, takich jak mutacje lub substytucje genów. Najbardziej rozwinięte dotychczas techniki edytowania genomu – ZFN i TALENs opierają się na zastosowaniu białek specyficznie wiążących DNA, takich jak białko palca cynkowego i białko TALE, w połączeniu z niespecyficzną endonukleazą FokI. Ze względu jednak na skomplikowaną metodykę i inne ograniczenia, technologie te nie były dotychczas szeroko stosowane u roślin. W przeciwieństwie do tych metod, nowa technologia edytowania genomu – CRISPR/Cas charakteryzuje się techniczną prostotą i wysoka wydajnością. System ten opiera się na bakteryjnym mechanizmie obronnym przed inwazyjnym DNA wirusowym lub plazmidowym i został zaadaptowany, jako doskonałe narzędzie do precyzyjnej modyfikacji genomu w szerokim zakresie organizmów. Najważniejszą zaletą tego systemu jest wykorzystanie pojedynczej, niekodującej cząsteczki sgRNA, która naprowadza nukleazę Cas9 do docelowej sekwencji DNA w genomie. Wystarczy zatem wprowadzenie pojedynczej konstrukcji genetycznej, zawierającej oba wymienione elementy w celu uzyskania ukierunkowanych mutacji w genomie roślinnym. W niniejszym projekcie zastosowane zostaną różne warianty techniki CRISPR/Cas w celu modyfikacji genomu jęczmienia i Arabidopsis. Do wprowadzenia ukierunkowanych mutacji do genów tych roślin posłużą różne kombinacje wektorów ekspresyjnych zawierających kasety CRISPR/Cas. Gen HvCKX1 koduje enzym oksydazy/dehydrogenazy cytokinin, który katalizuje nieodwracalną degradację hormonów cytokininowych. Został on wybrany jako obiekt naszych badań w celu dokładnego poznania procesów fizjologicznych zachodzących w dojrzewających nasionach pod wpływem cytokinin. Z kolei gen Nud został wybrany jako obiekt modelowy ze względu na możliwość bezpośredniej detekcji zmian fenotypu roślin w których zaszła ukierunkowana mutageneza. Mutacja genu Nud odpowiada za powstawanie nieoplewionych ziarniaków. Kasety CRISPR/Cas zostaną wprowadzone na drodze stabilnej transformacji genetycznej za pomocą Agrobacterium tumefaciens. Uzyskane rośliny transgeniczne będą analizowane przy użyciu różnych technik molekularnych w celu identyfikacji wprowadzonych mutacji. Geny zawierające mutacje zostaną sklonowane i zsekwencjonowane w celu analizy rodzaju i częstości uzyskanych modyfikacji. Dziedziczenie mutacji będzie analizowane w kolejnych pokoleniach T₂ i T₃ zmodyfikowanych roślin. Integralną częścią projektu jest analiza specyficzności techniki CRIPR/Cas poprzez identyfikację potencjalnych niespecyficznych mutacji, powstałych w innych miejscach genomu niż docelowe locus. Specyficzność systemu CRISPR/Cas będzie szczegółowo badana u Arabidopsis. 

Wpływ rezultatów 

Zastosowanie nowych metod edytowania genomów roślinnych, jako narzędzia badawczego, może mieć istotny wpływ na rozwój różnych gałęzi genetyki, zwłaszcza genomiki funkcjonalnej. Technologia CRISPR/Cas może być również istotnym wsparciem dla konwencjonalnej hodowli roślin, zwłaszcza w tych obszarach, gdzie osiągniecie postępu biologicznego przy pomocy tradycyjnych metod jest albo niemożliwe, albo jest bardzo kosztowne i czasochłonne.