[start]

[koniec]

Tytuł projektu:	Nowe ścieżki wyciszania RNA w analizie funkcjonalnej genów warunkujących ważne cechy użytkowe poliploidalnych zbóż
Tytuł (jęz. angielski):	The new RNA silencing pathways as tools in functional analysis of genes determining agriculturally important traits in polyploid cereals
Kierownik projektu:	prof. dr hab. Anna Nadolska-Orczyk
Numer umowy:	UMO-2011/03/B/NZ9/01383
Termin rozpoczęcia:	2012-08-14
Termin zakończenia:	2016-06-13

Opis rezultatów projektu:

Technologia wyciszania genów stała się świetnym narzędziem do analizy roli genów w wielu organizmach, włączając w to rośliny. Umożliwia również uzyskanie pożądanego fenotypu. Technologia bazuje na naturalnym mechanizmie regulacji ekspresji genów poprzez interferujące RNA (RNAi). Wyciszanie/regulacja ekspresji może przebiegać na poziomie transkrypcji (TGS) lub potranskrypcyjnie (PTGS). Biorą w niej udział krótkie, najczęściej 21 – 24 nukleotydowe RNA (sRNA) w tym microRNA i siRNA. Technologia RNAi jest szczególnie przydatna do analizy funkcji genów w poliploidalnych zbożach, jak pszenica i pszenżyto, posiadających bardzo duże i złożone genomy. Najszerzej stosowaną dotąd technologią wyciszania genów, w tym w pszenicy, i tylko przez nasz zespół w pszenżycie, opiera się na wykorzystaniu kaset wyciszających typu hpRNA, gdzie sygnał wyciszający jest przekazywany przez siRNA. W ramach projektu badaliśmy możliwości wykorzystania mechanizmu regulacji ekspresji genów na poziomie transkrypcyjnym TGS i z użyciem sztucznych mikro RNA (amiRNA) do wyciszania genów w poliploidalnych zbożach. Tego typu badania nie były dotąd prowadzone.

Opracowaliśmy ukierunkowaną metodę wyciszania ekspresji genów w poliploidalnych zbożach, pszenicy i pszenżycie z użyciem sztucznych mikro RNA (amiRNA). Wykazaliśmy, że jest ona wydajna i silniej specyficzna w stosunku do wcześniej opracowanej technologii opartej na interferencji RNA z użyciem kaset typu spinki (hpRNAi). W wyniku wyciszania genów związanych z twardością ziarna uzyskano spodziewany fenotyp u pszenicy. Udokumentowano również podobną rolę ortologów tych genów u pszenżyta, co nie było możliwe do wykazania w technologii siRNA. Wykazaliśmy, że wyciszenie genów odgrywających podobną rolę u obydwu gatunków, dało odmienny efekt związany z zawartością białka całkowitego w ziarniakach; u pszenicy zawartość białka była niższa a u pszenżyta wyższa. Zaskakującym wynikiem było, że silny i specyficzny sygnał wyciszania ekspresji badanych genów za pomocą amiRNA w pierwszym pokoleniu był wygaszany w następnym pokoleniu generatywnym, mimo prawidłowego dziedziczenia kasety wyciszającej. W przeciwieństwie, efekt wyciszania tych samych genów z użyciem  hp-RNAi był silny i stabilnie dziedziczony aż do czwartego pokolenia. Użycie do transformacji genetycznej amiRNA jednego z genów i jego ortologa blokowało formowanie zarodków somatycznych i tym samym otrzymanie roślin u obydwu gatunków. Sugeruje to negatywny wpływ niektórych sztucznych RNA na rozwój roślin.

Wykazano brak możliwości zastosowania technologii wyciszania transkrypcyjnego (TGS) do analizy funkcji genów w badanych gatunkach poliploidalnych zbóż.

Zidentyfikowano nowe rodzaje miRNA pszenicy poszerzające pulę dostępnych u pszenicy prekursorów, które mogą być wykorzystane do konstrukcji sztucznych miRNA, z uwzględnieniem ich aktywności i specyficzności tkankowej.

Badania przyczynią się do rozwoju technologii ukierunkowanego wyciszania ekspresji genów endogennych poliploidalnych zbóż. Tym samym zwiększą możliwości analizy funkcji genów, w tym genów warunkujących ważne cechy użytkowe. Analiza tego typu genów umożliwia poszukiwanie  w materiale genetycznym właściwego mutanta i/lub uzyskanie fenotypu o pożądanych cechach. Ponadto będzie możliwe opracowanie specyficznych znaczników molekularno-fizjologicznych danych genów o charakterze aplikacyjnym.